Στις παραμονές της Επανάστασης του 1821, η «Γκιαούρ Λιβαδειά», όπως την ονόμαζαν οι Τούρκοι για τον πολυάριθμο ελληνικό πληθυσμό της, είχε 10.000 Έλληνες κατοίκους, που επιδίδονταν στη γεωργία, το εμπόριο και τη βιοτεχνία. Το 1820 η πόλη ήταν το κέντρο των ενεργειών της Φιλικής Εταιρείας στην ανατολική Στερεά Ελλάδα, στην οποία και είχαν μυηθεί οι πρόκριτοί της Νικόλαος Νάκος, Ιωάννης Λογοθέτης και Ιωάννης Φίλων. Την εποχή εκείνη βοεβόδας της Λιβαδειάς ήταν ο Καρά Ισμαήλ Αγάς. Όταν ο τελευταίος έλαβε είδηση ότι κάποια κίνηση ετοιμάζουν οι Χριστιανοί κάτοικοι υποπτεύθηκε ότι ήταν ενέργεια του Αλή πασά σε αντιπερισπασμό εναντίον του οποίου κινούνταν σουλτανικά στρατεύματα.
Για το λόγο αυτό ζήτησε από τον ιεραρχικά προϊστάμενό του Πασά της Χαλκίδας τη θανάτωση όλων των προκρίτων της περιοχής ή τουλάχιστον τη σύλληψή τους, όπως είχε ενεργήσει και ο καϊμακάμης της Τριπολιτσάς.
Τότε οι παραπάνω τρεις πρόκριτοι όχι μόνο κατάφεραν με διάφορες ενέργειες και δωροδοκίες να κηρυχθούν αθώοι, αλλά και εκμεταλλευόμενοι την υψηλή προστασία της πόλης να πετύχουν την αντικατάσταση του βοεβόδα δια του Χασάν Αγά.
Έτσι ανεπιτήρητοι πλέον οι πρόκριτοι της Λιβαδειάς συνέχισαν την προετοιμασία της εξέγερσης ορίζοντας τον κάτοικο της Λιβαδειάς Αθανάσιο Διάκο (που είχε στο μεταξύ αποστατήσει από την Αυλή του Αλή πασά και είχε αναλάβει υπαρχηγός του αρματολού Οδυσσέα Ανδρούτσου και ειδικότερα τη φρούρηση της από Δαύλεια προς Αράχωβα και Άμφισσα οδικής διέλευσης), την ανάληψη της αρχηγίας των όπλων στη περιοχή σε συνεργασία με τον από Αράχοβα σύντροφό του Βασίλη Μπούσγο.
Η έκρηξη της Επανάστασης στη περιοχή της Λιβαδειάς εκδηλώθηκε τη νύκτα της 25ης προς την 26η Μαρτίου του 1821, όταν έπεσε το «πρώτο βόλι» από τον Βασίλη Μπούσγο και τους ένοπλους άνδρες του (που του είχαν θέσει στη διάθεσή του οι προύχοντες της Αράχοβας), στη θέση «στενό του Ζεμενού» σκοτώνοντας μερικούς Τούρκους. Η εμπλοκή αυτή που φέρεται να έγινε με υπόδειξη του Αθανασίου Διάκου λόγω της παρατεινόμενης ασυμφωνίας και αναβλητικότητας των προκρίτων της Λιβαδειάς, όπως ομοίως συνέβη και στα Καλάβρυτα, έσπευσε στη συνέχεια να την παρουσιάσει ευφυέστατα στον Χασάν Αγά της Λιβαδειάς ο ίδιος ο Διάκος ως δήθεν επίθεση της εμπροσθοφυλακής του Ανδρούτσου που πλησιάζει με 10.000 Έλληνες επαναστάτες. Κατόπιν αυτού, την ίδια ημέρα (26 Μαρτίου) ο Αθανάσιος Διάκος έλαβε την άδεια της ελεύθερης στρατολόγησης ενόπλων ανδρών.
Παρότι και σε νέα προσπάθεια ο Αθανάσιος Διάκος δεν πέτυχε τη σύμπνοια των προκρίτων, προχώρησε σε πολεμικές ενέργειες αγνοώντας τους. Έτσι τη νύχτα της 28ης προς την 29η Μαρτίου ηγούμενος των στρατολογημένων από τον ίδιο επαναστατών κατέλαβε τον λόφο του Προφήτη Ηλία κατ΄ απέναντι θέση από το κάστρο της Λιβαδειάς, στο οποίο καθώς και στον Πύργο Ώρα, στο μέσον της πόλης, είχαν καταφύγει οι Τούρκοι έχοντας μαζί τους ως ομήρους τους προεστώτες Ν. Νάκο και Λογοθέτη μόλις έμαθαν τον ξεσηκωμό της Άμφισσας. Από εκεί, μετά την άρνηση του Χασάν αγά να παραδώσει την πόλη, ο Αθανάσιος Διάκος άρχισε την επίθεση. Στις 31 Μαρτίου κατελήφθη η πόλη ενώ οι Τούρκοι, που είχαν κλειστεί στον πύργο Ώρα, παραδόθηκαν και την 1η Απριλίου παραδόθηκε το κάστρο. Σε πανηγυρική δοξολογία που φέρεται να ακολούθησε στην εκκλησία της Αγίας Παρασκευής, οι επίσκοποι Σαλώνων, Ταλαντίου (Αταλάντης) και Αθηνών ευλόγησαν την επαναστατική σημαία του Διάκου.
Δύο μήνες περίπου μετά, στις 26 Ιουνίου διερχόμενος από την περιοχή ο Ομέρ Βρυώνης καταλαμβάνοντας την πόλη, εκτός του κάστρου πυρπόλησε μεγάλο μέρος της αυτής. Γενικά κατά τη διάρκεια της Επανάστασης η πόλη δοκιμάστηκε επανειλημμένα από τις τουρκικές στρατιές που κατευθύνονταν στην Πελοπόννησο, και στην περιοχή δόθηκαν οι τελευταίες μάχες του Αγώνα. Κατά τις επιχειρήσεις του 1828 στην Ανατολική Στερεά, με επικεφαλής τον Δημήτριο Υψηλάντη, οι Τούρκοι που βρίσκονταν στη Λιβαδειά πολιορκήθηκαν από το σώμα του Βάσου Μαυροβουνιώτη και από άτακτο ιππικό, και στις 5 Νοεμβρίου 1828 παρέδωσαν την πόλη. Νέο όμως τουρκικό σώμα υπό τον Μαχμούτ πασά κατέλαβε και πάλι τη Λιβαδειά, που αναγκάστηκε όμως να την εγκαταλείψει στις 8 Φεβρουαρίου 1829, για να αποφύγει την κύκλωση με το σχέδιο που εφάρμοζε ο Γεώργιος Καραϊσκάκης. Μετά δε τη μάχη της Πέτρας εξαφανίστηκαν και όλοι οι Τούρκοι από την Βοιωτία.
Με τη συγκρότηση του υποτυπώδους ελληνικού «κράτους κατ’ εντολή», επί Ιωάννη Καποδίστρια, η Λιβαδειά άρχισε να ανασυγκροτείται. Οι κάτοικοι που είχαν καταφύγει σε άλλες περιοχές επανήλθαν και το 1841 η πόλη ήταν πλέον ένα από τα εύρωστα οικονομικά κέντρα του νεοπαγούς Ελληνικού Βασιλείου.